ESPERIENZA DEL CE.R.M.A.S. SULLA RICERCA DI Salmonella SPP. IN CARNIVORI, MUSTELIDI E VOLATILI SELVATICI

Salmonella spp. è un microrganismo batterico, agente di zoonosi, capace pertanto di costituire anche un problema sanitario per gli animali e l’uomo.
Il genere Salmonella, appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae, comprende due specie: S. enterica e S. bongori.

S. enterica, a sua volta, annovera sei sottospecie, entericae, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica. La maggior parte delle salmonelle appartengono alla sottospecie S. enterica subsp. enterica, i cui sottogruppi sono generalmente definiti sulla base del sierotipo (Report Zoonosi EFSA).

La capacità di adattamento del microrganismo all’ospite, e quindi la sua stessa patogenicità, varia a seconda del sierotipo. Alcuni sierotipi riconoscono infatti uno specifico ospite (sierotipi specie-specifici), altri si adattano a ospiti diversi pur mantenendo una predilezione per determinate specie animali (sierotipi adattabili) e infine esistono sierotipi ubiquitari che possono infettare più specie animali e soprattutto l’uomo (Velge P. et al, Vet Res 2005).

Come per altri agenti patogeni, le infezioni da Salmonella spp. negli animali possono essere, in molti casi, asintomatiche. Tuttavia, in particolari condizioni in cui le difese dell’ospite sono compromesse o in cui l’ambiente microbico intestinale è alterato (ad esempio per squilibri alimentari o per la presenza di concomitanti processi infettivi/infestivi), si possono osservare sintomi a carico dell’apparato digerente (enterite) e, nei casi più gravi, possono essere colpiti altri organi nel momento in cui il germe diffonde nel resto dell’organismo.

Quando Salmonella spp. raggiunge l’utero gravido si può assistere ad aborto o mortalità neonatale (tra gli esempi più tipici, Salmonella abortus equi per gli equini e Salmonella abortus ovis per gli ovi-caprini).

Una volta penetrato nell’organismo, in genere per via orale, Salmonella spp. scatena un processo patogenetico molto complesso che dipende da diversi fattori. I batteri ingeriti raggiungono l’intestino e in seguito al contatto con l’epitelio intestinale alcune proteine somatiche entrano nelle cellule ospiti causando alterazione del citoscheletro e permettendo la successiva penetrazione di microrganismi nelle cellule stesse.

In contemporanea, nell’ospite si innesca un richiamo nella lamina propria dell’epitelio di neutrofili e macrofagi, cellule di difesa che hanno lo scopo di fagocitare i batteri. La reazione infiammatoria si manifesta talora con la migrazione di granulociti neutrofili, attraverso l’epitelio mucosale, nel lume intestinale, a cui si aggiunge richiamo di liquidi e distacco dell’epitelio stesso dalla membrana basale con conseguente diarrea a sfondo emorragico.

La gravità dei sintomi clinici dipende dal numero di batteri ingeriti (la dose minima infettante è pari a circa 102-103 cellule), dal corredo genetico dei ceppi coinvolti e dalle condizioni dell’ospite. Anche i fattori ambientali, quali temperatura e umidità possono favorire una moltiplicazione batterica tale da provocare l’infezione.

Come anticipato nella patogenesi, la via di trasmissione principale è quella oro-fecale, di conseguenza acqua e alimenti rappresentano le vie di ingresso preferenziali per il patogeno.
La trasmissione di Salmonella spp. può essere sia orizzontale che verticale, ovvero il microrganismo può trasferirsi facilmente da un animale all’altro così come può essere trasmesso alla progenie.

In seguito all’infezione, gli animali possono ammalarsi oppure diventare portatori sani con possibilità di escrezione intermittente o persistente di salmonelle.
Le salmonellosi rappresentano un problema di sanità pubblica: Salmonella spp. è infatti, insieme a Campylobacter, responsabile della maggior parte delle tossinfezioni alimentari nell’uomo.

Notevoli sono i risvolti economici negativi, legati ai provvedimenti sanitari, che conseguono alla diffusione di salmonelle all’interno di allevamenti di animali destinati al consumo umano. Alla luce di questo, la Comunità Europea ha stabilito, nell’ambito del controllo delle zoonosi, dei piani obbligatori di sorveglianza delle salmonellosi (Direttiva 99/2003/CE, Regolamento 2160/2003/CE). Nello stesso contesto è stata anche istituita una rete europea, Enter-net (Enteric Pathogen Network), con il preciso scopo di monitorare i batteri enteropatogeni tra cui, ovviamente, Salmonella spp.

Nonostante il costante controllo sanitario, che ha determinato negli ultimi anni una progressiva diminuzione dei casi di infezione, il numero complessivo delle salmonellosi rimane comunque elevato (nel 2005 sono stati registrati 177963 tossinfezioni umane nei Paesi della Comunità Europea).

Nel complesso ciclo di diffusione di Salmonella spp. possono rientrare anche gli animali selvatici, che assumono in genere il ruolo di portatori asintomatici ma con possibilità di eliminare il microrganismo.

Non esistono ad oggi molti studi riguardanti la prevalenza di Salmonella spp. nei mammiferi selvatici, mentre alcune ricerche sono state effettuate sull’avifauna. E’ stato infatti accertato che S. typhimurium si trova comunemente nell’intestino degli uccelli selvatici. Il più semplice meccanismo attraverso cui il batterio si diffonde nell’avifauna selvatica consiste nel consumo di carcasse contaminate, abitudine che contraddistingue gli uccelli rapaci e gli uccelli necrofagi, quali corvi e gabbiani. In seguito all’ingestione di carcasse infette, Salmonella spp. può integrarsi nella flora intestinale dell’organismo ospite, che a sua volta può dunque diventare un portatore sano capace di eliminare salmonelle con le feci in modo costante (escretore permanente) o per un breve periodo (escretore temporaneo).
Nella prima condizione predomina uno specifico sierotipo, mentre nella seconda ne possono essere presenti contemporaneamente più di uno (Tizard I, Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine, 2004).

In considerazione del ruolo attribuito alla fauna selvatica nell’epidemiologia delle salmonellosi, abbiamo effettuato la ricerca del microrganismo in alcune specie selvatiche, in prevalenza mammiferi carnivori e avifauna, provenienti dalla regione Valle d’Aosta


Materiali e metodi
Sono stati presi in considerazione complessivamente 906 esemplari di fauna selvatica, provenienti dalla Regione Valle d’Aosta e sottoposti a necroscopia presso il Ce.R.M.A.S. (Centro di Referenza Nazionale per le Malattie degli Animali Selvatici - Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta) nel periodo 2003-2006.


Gli animali appartenevano ai seguenti gruppi: 200 canidi, 85 mustelidi, 621 uccelli selvatici. In Tabella 1 vengono riportate le specie campionate per ogni gruppo. Gli esemplari sono stati per lo più rinvenuti morti sul territorio (in genere deceduti in seguito a traumi o incidenti stradali) e in minor misura abbattuti nell’ambito di piani regionali o provinciali.

Sugli animali sottoposti a necroscopia è stato possibile eseguire complessivamente 1124 esami per la ricerca Salmonella spp.; gli organi campionati sono stati (a seconda delle condizioni della carcassa) intestino, fegato, feci (o tamponi cloacali) e linfonodi meseraici.
L’isolamento di Salmonella spp. è stato effettuato con il metodo classico che si articola nelle seguenti quattro fasi.

La prima, detta fase di prearricchimento, consiste nell’incubare i campioni in acqua peptonata (BPW). Questo passaggio è necessario per “rivitalizzare” le eventuali salmonelle presenti sottoposte allo stress del congelamento (la maggior parte delle carcasse erano conservate a –20°C). I campioni vengono previamente sottoposti ad un processo di omogenizzazione mediante l’uso di Stomacher.

Dopo 18 ore circa di incubazione, si passa alla fase di arricchimento in cui il brodo BPW precedentemente seminato viene trasferito nei brodi selettivi Selenite Cystine Broth (SC) e Mueller Kauffman Tetrathionate Broth (MK); tali terreni dovrebbero permettere solo la crescita di Salmonella spp., inibendo tutti gli altri batteri contaminanti.

Nella fase di isolamento i brodi SC e MK vengono seminati su terreni agarizzati selettivi- differenziali, in genere Brilliant Green Agar e XLD, sui quali le colonie di Salmonella spp. crescono con morfologia e colore caratteristici. Le colonie che risultano sospette vengono trasferite su TSI (Triple Sugar Iron), un terreno per l’identificazione presuntiva delle Enterobacteriacee basata sulla fermentazione degli zuccheri e sulla produzione di H2S.

Le colonie con crescita tipica su TSI vengono infine sottoposte alla fase di conferma sierologica e identificazione biochimica, utilizzando rispettivamente un siero polivalente (valido per quasi tutti i gruppi di Salmonella spp.) e una galleria API E della Biomerieux (comprendente diversi test biochimici).

Le colonie identificate come Salmonella spp. sono state successivamente inviate al Laboratorio Controllo Alimenti (sede IZS PLV di Torino) per la definizione del sierotipo e da qui, nei casi di S. typhimurium e S. enteritidis, al Centro di Referenza Nazionale per le Salmonellosi (IZS delle Venezie – Padova) per la definizione del fagotipo.


Risultati
Salmonella spp. è stata isolata 43 volte, precisamente dagli organi di 17 canidi, 17 mustelidi e 3 uccelli selvatici. Non essendo mai stati osservati reperti anatomo-patologici di enterite emorragica, gli animali positivi sono comunque da considerarsi portatori sani.
In tabella 2 si evidenzia la distribuzione delle positività nel periodo considerato.




Come prima considerazione, è utile ricordare che le volpi sono definite animali opportunisti in riferimento alle loro abitudini alimentari; esse presentano infatti una nicchia trofica particolarmente ampia che spazia da frutta e cereali fino a piccoli mammiferi, uccelli, anfibi e artropodi.

A quest’ultimo riguardo, l’ingestione di carcasse infette risulta sicuramente, per la volpe, un fattore di rischio per l’infezione salmonellare. Comunque per attribuire una maggiore significatività ai dati ottenuti ed avere pertanto una valutazione complessiva della diffusione di Salmonella spp. nelle varie specie campionate sarebbe necessario avere una stima della consistenza totale di ogni gruppo (canidi, mustelidi e uccelli selvatici) nel territorio valdostano.

Nella tabella 3 si riportano invece le positività di feci e linfonodi meseraici prelevati da canidi e mustelidi.

A questo riguardo negli animali per i quali è stato possibile analizzare sia feci che linfonodi meseraici, la positività è stata rilevata per lo più soltanto nei secondi. I dati complessivi della tabella, a fronte del fatto che non vi erano lesioni anatomo-patologiche riferibili ad enterite salmonellare, suggeriscono che la maggior parte degli animali selvatici analizzati sono da considerarsi portatori sani non escretori (feci negative - linfonodi positivi) e in minor misura portatori sani escretori (feci positive e linfonodi negativi o positivi).

Innanzitutto, posto che non esiste un sierotipo prevalente, sono state comunque isolate salmonelle che attualmente vengono individuate dalla Commissione Europea come “rilevanti per la salute pubblica”, quali S. typhimurium e S. enteritidis (Reg. 1003/2005/CE).
In particolare, è intessante sottolineare che il sierotipo S. typhimurium è stato rilevato in tutti i gruppi animali presi in considerazione (vedi specifiche nella Tabella 4).



In conclusione, i dati raccolti portano ad alcune considerazioni. Innanzitutto, appare interessante la presenza di numerosi sierotipi notoriamente responsabili di tossinfezioni umane, primo fra tutti S. typhimurium (rilevato in tutti e tre i gruppi testati, ovvero canidi, mustelidi e avifauna) seguito poi da S. heidelberg, S. napoli, S. livingstone e S. coeln.

Pur essendo questi sierotipi pericolosi per l’uomo (tramite contaminazione degli alimenti), rimane comunque da chiarire il ruolo concreto degli animali selvatici in merito alla loro diffusione sul territorio. Gli isolamenti eseguiti infatti dimostrano che la maggior parte dei soggetti testati può essere classificato come portatore sano non escretore a fronte del fatto che le salmonelle sono state ritrovate soltanto nei linfonodi meseraici e non nelle feci.

Poiché la sorveglianza effettuata è stata di tipo passivo, sarebbe opportuno valutare la reale incidenza di Salmonella spp. nei vari gruppi animali, correlata alla consistenza numerica delle varie specie nella regione valdostana.